Den snarrådige nattevagt Larry Daley (Ben Stiller) er tilbage blandt de udstillede mennesker og dyr, som han lærte at kende på New Yorks Naturhistoriske Museum for tre år siden. Her i opus 2 har Larry fået opfyldt sin drøm og er blevet opfinder. Men de gamle bekendtskaber fra det museale natteliv lokker ...

Da Larry får at vide, at alle museets udstillede figurer skal opmagasineres i kælderen under the Smithsonian Institution i Washington, DC, rejser han resolut dertil. Her er en ny trussel mod verdensfreden under opsejling i skikkelse af den brutale egyptiske farao Kahmunrah (Hank Azaria), og på ny får Larry hjælp af miniaturecowboyen Jedediah (Owen Wilson), Teddy Roosevelt (Robin Williams), Octavius (Steve Coogan), Sacajawea (Mizuo Peck), Attila (Patrick Gallagher) og Neandertalerne samt ikke mindst den ukueligt dristige og bedårende pionerpilot, Amelia Earhart (Amy Adams), som samtidig får Larry til at genopdage sin forsvundne sans for sjov og ballade.

Larry Daley	Ben Stiller
Amelia Earhart	Amy Adams
Jedediah Smith	Owen Wilson
Kahmunrah	Hank Azaria
Teddy Roosevelt	Robin Williams
Ivan the Terrible	Christopher Guest
Napoleon	Alain Chabat
Octavius	Steve Coogan
Dr. McPhee	Ricky Gervais
General Custer	Bill Hader